Главная


купить натяжные потолки набережные челны

Клонирование х-кДНК

Основным инструментом при использовании метода рекомбинатных ДНК служит внушительный набор ферментов (из различных биологических источников), действующих на нуклеиновые кислоты специфическим путем. Это ферменты, удаляющие и присоединяющие концевые фосфатные группы, специфически расщепляющие одно- или двухцепочечные ДНК и РНК, ковалентно сшивающие фрагменты ДНК, а также ферменты, синтезирующие цепи, комплементарные одноцепочечным ДНК или РНК. Наиболее важное значение при этом имеют ферменты, называемые «рестриктирующими эндонуклеазами» или «рестриктазами». Эти ферменты расщепляют ДНК в специфически распознаваемых участках, обычно состоящих из 4—6 нуклеотидов и имеющих «палин- дромную» последовательность, т. е. узнаваемая последовательность располагается на обеих цепях ДНК в одном и том же положении. Ферменты, узнающие различные последовательности, выделяют из бактерий разных видов и штаммов, где они служат для расщепления проникшей в клетку чужеродной (например, вирусной) ДНК. (Собственная ДНК бактерии защищена от фермента метилированием.) Многие из этих ферментов расщепляют комплементарные цепи в точках, смещенных относительно друг друга, с образованием «липких концов», которые при отжиге быстро комплексируются и легко могут быть ковалентно сшиты ДНК-лигазой. Липкие концы могут быть созданы и искусственно, при помощи фермента концевой трансферазы, если, как показано, построить poly-dG-концы у одного фрагмента ДНК и комплементарные poly-dC-концы у другого фрагмента. С помощью именно этих реакций кДНК, скопированная с очищенной мРНК χ-Ig, была встроена в плазмидный вектор, называемый pBR322.

Методы генетической инженерии и клонирование кДНК

Наверху слева показана независимо реплицирующаяся плазмида pBR322, часто используемая в качестве вектора для введения ДНК
в бактериальные клетки. Плазмида содержит единственный сайт расщепления ферментом Pstl, последовательность нуклеотидов которого приведена на рисунке.
Верхняя последовательность, как это принято, за-писана в направлении 5' → 3' (слева направо)',
внизу дана комплементарная последова-тельность в противоположной ориентации. Одна и та же последовательность читается слева направо
в верхней цепи и справа налево в нижней, что типично для сайтов узнавания рестриктазами. Места расщепления Pstl внутри узнаваемой ферментом последовательности обозначены
вертикальными черточками. После расщепления остаются четырехнуклеотидные одноцепочечные комплементарные выступы («липкие концы»)
на обоих появляющихся концах, как показано внизу. Для клонирования кДНК эти концы наращивают, достраивая гомополимер из остатков dG. ДНК-вставку получают
на мРНК с использованием приведенных справа ферментативных стадий. У вставки наращивают концы из oligo-dC,
комплементарные соответствующим концам вектора. Вектор и вставку соединяют и вводят в бактерию при таких разведениях, чтобы ни одна из клеток
не получила более одной плазмиды. После отбора бактериальной колонии, содержащей нужный ген, эти клетки могут быть выращены в больших количествах.
Плазмида, полученная из таких клеток, может быть расщеплена Pstl, и свободная ДНК-вставка может быть отделена от вектора (внизу).

Полученная рекомбинантная плазмида была введена в бактерию Escherichia coli путем ее трансформации. В экспериментах такого рода лишь небольшая часть бактерий получает молекулу плазмиды, однако эти немногие бактерии могут быть выращены селективно на среде, содержащей тетрациклин. Плазмида содержит ген устойчивости к тетрациклину, защищающий от его действия бактерию-хозяина, тогда как нетрансформированные клетки в присутствии тетрациклина не размножаются. Хотя в исходном препарате кДНК может содержаться смесь нескольких последовательностей (в зависимости от чистоты исходно использованной мРНК), каждая колония трансформированных бактерий, растущая на чашке с содержащим тетрациклин агаром, содержит многие тысячи бактерий, являющихся потомками одной клетки, захватившей одну-единственную плазмидную молекулу. Таким образом, каждая клетка колонии содержит плазмиды с идентичной встроенной последовательностью, которая таким образом «клонируется». Плазмидную ДНК можно выделить из жидких бактериальных культур, происходящих из одной колонии, и получить таким способом чистую ДНК-вставку в количествах, достаточных для анализа нуклеотидной последовательности.

Описанный метод использовали для клонирования кДНК для χ-Ig мыши в 1978 г. Сейдманидр. Ленхард-Шуллер и др. и Хэмлин и др. (Вторая из этих групп годом раньше сообщила о клонировании кДНК для λ-Ig мыши.) Идентичность этих клонов была проверена несколькими методами, в том числе прямым определением нуклеотидной последовательности. «Выведенная» на основе нуклеотидного анализа последовательность аминокислот оказалась полностью идентичной химически определенной последовательности миеломных х-цепей BALB/c.